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人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子試劑盒使用方法說明

點擊次數:777 更新時間:2014-09-09
 

人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子試劑盒使用方法說明

使用目的:

試劑盒用于測定人血清、血漿及相關液體樣本中粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子

(GM-CSF)含量。

實驗原理

試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)

水平。用純化的人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)抗體包被微孔板,制成固相

抗體,往包被單抗的微孔中依次加入粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF),再與HRP

標記的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合

物,經過*洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作

用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)

呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),通過標準曲線計算樣品中人粒

細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)濃度。

試劑盒組成

1 30 倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶 7 終止液 6ml×1 瓶

2 酶標試劑 6ml×1 瓶 8 標準品(320ng/L) 0.5ml×1 瓶

3 酶標包被板 12 孔×8 條 9 標準品稀釋液 1.5ml×1 瓶

4 樣品稀釋液 6ml×1 瓶 10 說明書 1 份

5 顯色劑A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2 張

6 顯色劑B 液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 個

標本要求

1.標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能

馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融

2.不能檢測含NaN3 的樣品,因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

試劑盒操作步驟

1. 標準品的稀釋:本試劑盒提供原倍標準品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀

釋。

160ng/L 5 號標準品 150μl 的原倍標準品加入150μl 標準品稀釋液

80ng/L 4 號標準品 150μl 的5 號標準品加入150μl 標準品稀釋液

40ng/L 3 號標準品 150μl 的4 號標準品加入150μl 標準品稀釋液

20ng/L 2 號標準品 150μl 的3 號標準品加入150μl 標準品稀釋液

10ng/L 1 號標準品 150μl 的2 號標準品加入150μl 標準品稀釋液

2. 加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、標準孔、

待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,

然后再加待測樣品10μl(樣品zui終稀釋度為5 倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡

量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。

3. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。

4. 配液:將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用

5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 秒后棄去,如此

重復5 次,拍干。

6. 加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。

7. 溫育:操作同3。

8. 洗滌:操作同5。

9. 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色

15 分鐘.

10. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。

11. 測定:以空白空調零,450nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD 值)。測定應在加終止

液后15 分鐘以內進行。

操作程序總結:

計算

以標準物的濃度為橫坐標,OD 值為縱坐標,在坐標紙上繪出標準曲線,根據樣品的

OD 值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數;或用標準物的濃度與OD 值計算出標

準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD 值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數,

即為樣品的實際濃度。

 
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