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| ELISA試劑盒免疫組織化實驗代測染實驗計劃 |
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| 點擊次數(shù)：874 更新時間：2019-01-18 |
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1．實驗計劃
① ELISA試劑盒根據(jù)課題的內(nèi)容選用動物，選用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗體，與其他種屬間無 交叉，則不能用其他 動物，而且Ab-Ⅱ必須是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必須來源于鼠，否則不能連接成復(fù)合物。
② 若要比較染色深淺在對照組與實驗組間的差異，在貼片方面貼于同一張載片上，否則無可比性。
③ 選用的試劑可靠，貨源充足，隨時可取。
2．Ab稀釋度 （如系購買的藥盒有工作液和原液）
（1）工作液：無須稀釋
（2）原液：
① 應(yīng)參照其提供的工作液濃度進行預(yù)試驗驗。
如：工作液濃度為1∶1000， 可選1∶500，1∶1000，1∶1500試驗；
若: 1∶500有背景，1∶1000陽性反應(yīng)稍淺，可選1∶750進行試驗。
② 原液的保存（—20℃）凍存——應(yīng)選稀度凍存。
③ 若工作濃度大于1∶500則要先將原液稀釋十倍，而后分裝10μl/瓶→凍存（-20 ℃）于 冰箱備用。
④ 關(guān)于Ab保存應(yīng)參照說明書。
（3）Ab濃度的選擇
Ab濃度不可太高或太低，因為Ag-Ab結(jié)合需在一定濃度范圍內(nèi)進行，若一方過剩則形成復(fù)合物小且少；極 過剩時已形成的復(fù)合物亦會解體而呈現(xiàn)假陰性。——并非Ab濃度越高越好。
3．Ab滴片技術(shù)
—— 所滴的抗體應(yīng)與切片上的組織剛好吻合。
[注意] 滴抗體前需把切片上的水弄干，但不能干片。
要領(lǐng)：甩凈組織周圍的水。
4．PBS洗滌技術(shù)
（1）洗滌的目的
① 保證離子濃度和PH值。
② 減少非特異反應(yīng)（平時Ab不可靠很純）
（2）方法：洗三次，每次5分鐘。
5．Ab孵育技術(shù)
（1）必須在濕盒內(nèi)進行，以防抗體的蒸發(fā)和干片。
（2）溫度與時間 4℃：過夜；
37℃：2 h or 參考說明書
6．光鏡控制顯色方法
（1）室內(nèi)操作：注意溫度與時間的關(guān)系，室溫zui宜5分鐘。
（2）染色稍淺亦可拿出，脫水，封片后顏色可加深。
對照組和染色結(jié)果的評價
從以下幾 個方面綜合評價：
1．陽性染色特點
① Ag定位，胞漿、胞核、胞膜、間質(zhì)具有結(jié)構(gòu)性。（非特異性～細胞與組織無區(qū)別）
② 染色強度不同：顏色深淺不一（非特異性染色 彌散性均勻）
2．組織切片制作過程的影響
① 固定不良—非特異性染色，顯示不均。
② 邊緣干燥—非特異性染色（常見），加抗體時勿干片。
3．ELISA試劑盒人工假象與特異性結(jié)果顯示不在同一平面上。
陽性對照：
用已知抗原陽性的切片與待檢標(biāo)本同時進行免疫細胞化學(xué)染色。對照切片呈陽性結(jié)果，標(biāo)為陽性對照。
陰性對照：
用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對照，應(yīng)呈陰性結(jié)果，稱陰性對照。其實這只是陰性對照中的一種，陰性對照 還應(yīng)包括空白、替代、吸收和抑制實驗。
▲ 染色失敗的幾種原因：
（1）所染的全部切片均為陰性結(jié)果，包括陽性 對照在內(nèi)。全部（－）原因可能：
① 染色未*嚴(yán)格按照操作步驟進行；
② 漏加一種抗體，或抗體失效；
③ 底物中所加H2O2 量少或失效；
￥ 復(fù)染或脫水劑使用不當(dāng)
（2）所有切片均呈陽性反應(yīng)，原因可能是：
① 切片在染色過程中抗體過濃，或干燥了。
② 緩沖液配置中未加氯化鈉和PH值不準(zhǔn)確，洗滌不*。
③ 使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反應(yīng)時間過長。
④ 抗體溫育的時間過長。
⑤ H2O2 濃度過高，呈色速度過快。粘附劑太厚。
（3）所有切片背景過深，原因可能是：
① 未加酶消化處理切片。
② 切片或涂片過厚。
③ 漂洗不夠。
④ 底物呈色反應(yīng)過久。
⑤ 蛋白質(zhì)封閉不夠或所用血清溶血。
⑥ 使用全血清抗體稀釋不夠。
（4）ELISA試劑盒陽性對照染色良好，檢測的陽性標(biāo)本呈陰性反應(yīng)。
zui常見的原因是：標(biāo)本的固定和處理不當(dāng)。 |
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